indicator (indicator) wrote,
indicator
indicator

Застать за работой и оставить в живых

Профессор Юрий Корчев о нанокапиллярах для изучения живой клетки


Jo Yong hak/Reuters

Как можно «подсмотреть» за жизнью отдельных молекул, позволяющих нам слышать, видеть, ощущать запахи и просто существовать, не в замочную скважину традиционных методов, а через широкое окно новых возможностей, чем электронная микроскопия похожа на работу археолога с египетскими мумиями, как использовать мобильный телефон для слежки за раковыми клетками, читайте в нашем материале.

Живая клетка — невероятное сочетание гибкости и хрупкости. «Прикоснуться» к ней измерительным прибором и при этом не изменить ее параметров и не убить — сложнейшая задача, которая долгое время оставалась практически неразрешимой. Профессор Юрий Корчев, руководитель проектов по разработке технологий на основе нанокапилляров в НИТУ «МИСиС» и Имперском колледже Лондона, рассказал корреспонденту Indicator.Ru, как новый способ позволяет наблюдать живую клетку в процессе работы и регистрировать поступающие в нее вещества, а также чем этот новый метод, достоинствами которого являются чувствительность и избирательность, отличается от уже существующих в микроскопии методов.

Ионная микроскопия — изучение анатомии человека по мумии

— Расскажите, пожалуйста, подробнее о своей технологии: какими видами нанокапилляров занимаетесь вы?

— Технология производства капилляров довольно проста: можно купить готовые капилляры, а дальше есть так называемый пулер — это такая «тянучка», которой можно разогревать капилляр в одной точке. И потом, если резко потянуть, почти как стеклодув, получаешь очень тонкие капилляры. Если очень быстро это делать, получается разрыв, где кончики капилляров будут толщиной до 10 нанометров – очень маленькие, их невооруженным глазом не увидишь. Это позволяет получать такие нанообъекты очень простым и легко воспроизводимым способом.

Дальше с ними можно производить много манипуляций, например, использовать напрямую как сенсор расстояния, заполнив электролитом и измеряя ионный ток. В таком случае можно бесконтактно получать картинки, подобные сканирующей электронной микроскопии, но абсолютно живых образцов. Способ уникальный, так как сейчас любая электронная микроскопия производит огромное количество артефактов. Мой любимый пример: электронная микроскопия — это как привезти из Египта мумию и сказать «ой, какая она вся классная, сохраненная и высушенная, и вот мы по ней будем сейчас изучать живого человека». Но нужно смотреть на «живые» особенности, если мы хотим исследовать, как клетка работает, как реагирует на лекарства. Наш капилляр мы можем контролировать на очень коротком расстоянии (в нанометрах) от поверхности живой клетки или ткани и с его помощью бесконтактно получать картинку высокого разрешения.

— А какой примерно диаметр имеют эти нанокапилляры?

— Все зависит от цели. Если мы хотим посмотреть на одиночные белки, мы используем диаметры около 10 нанометров, а если исследовать аксоны — около 50 нанометров. Это простая арифметика: для больших объектов нет смысла в капилляре 10 нм, потому что там нужна информация с большого количества точек. Наши рабочие капилляры обычно 10-50 нм.

— Из каких материалов вы их делаете?

— Обычно мы используем буросиликатное стекло, с ним очень легко работать. Особый пулер, которым делают эти капилляры, требуется только для кварца. Зачем кварц, спросите вы? Из него можно вытянуть еще более тонкие капилляры. Они получаются более жесткими и огнеупорными. Для этого нужна не обычная нить накала, как в утюге или лампочке, а лазерный луч, который легче контролировать и которым можно разогреть кварц.

Чувствительность и избирательность нанобиосенсора

— Каким образом собирается информация?

— [Информацию] собирает такой, как мы его называем, наноробот. Если капилляр крепить на трехмерном манипуляторе, для этого используются пьезокристаллы, потому что можно двигаться очень-очень точно. Когда мы двигаем капилляр вокруг, мы можем измерять расстояние. Он подходит на расстояние 20 нм до поверхности и двигается с помощью манипуляторов. Подавая определенное напряжение, мы знаем положение капилляра в трехмерном пространстве. Собирая точку за точкой и записывая координаты, мы можем собрать картинку поверхности. Это как топография: горы, но только нанометровых размеров. Эти пьезокристаллы имеют особые сенсоры, которые корректируют все нелинейности, и мы можем получить картинку очень высокого разрешения, интактную клетку, живую, посмотреть, как она движется и что она делает.

Дальше начинается самое интересное: да, хорошо, увидел картинку, как она живет и что происходит, но этого мало. Этот же капилляр научились использовать и для измерения других параметров: температуры, pH, электрофизиологии. Вы находите определенную точку (это почти как ракета с наведением), можно туда пойти и записать, например, работу одиночных белков, одиночных ионных каналов. Это наши рецепторы — все, что мы видим, слышим, двигаемся, чувствуем, — эти каналы он может найти великолепно.

Функции уникальны, и мы можем совместить две-три: внутри стоит стеклянная перегородка, которая разделяет капилляр на несколько каналов. Один мы можем использовать для позиционирования, а другой – наполнить особым углеродом. Он высокопроводящий, почти как графит. Он может быть модифицирован для электрохимических исследований, чтобы определять концентрацию многих химических элементов в трехмерном пространстве в заданной точке, и его легко поместить именно туда.

Обычно возникает вопрос – если сенсоры нанометровые, как мы можем ими что-то измерять? Если его просто взять в руки или коснуться чего-то, он будет разбит, разломан, повредит образец… В данном случае возможности капилляра уникальны: он может четко позиционироваться и никогда не войти в контакт.

В последней нашей разработке мы его собрали еще интереснее: на кончик капилляра был помещен электронный транзистор. Он называется FET – field effect transistor. В чем суть его работы? У любого транзистора есть база. Чем она меньше, тем она более чувствительна. Такая база может связывать какой-то белок, или то, что мы хотим почувствовать. И в ответ она меняет потенциал, резко усиливается ток, проходящий через коллектор.

Получается, что чем транзистор меньше, тем он чувствительнее для определения каких-либо химических элементов. Собрав это, мы получаем не просто сенсор, который может чувствовать с необычайной точностью любой сигнал. Ему не нужен усилитель: все усиление происходит прямо на кончике капилляра, где проводится измерение. То есть, мы получаем нанометровый биосенсор с необычайно высокой чувствительностью. Для других сенсоров наоборот: чем больше сенсор, тем больше можно определить или почувствовать.

Измерить, нельзя изменить

— А такое вмешательство при измерении никак не изменяет параметры клетки? Может, оно переносит какой-то заряд, влияет на одиночные белки, к которым приближается нанокапилляр?

— Это очень хороший вопрос. Потому что это проблема всех сенсоров и любых измерений в том, насколько твое измерение взаимодействует с образцом и его изменяет. Раньше, когда использовали крупные химические сенсоры, хотели посмотреть, например, потребление клеткой кислорода. Кажется, такое простое явление: каждая клетка дышит и его потребляет. Скажем, мы хотим измерить уровень кислорода возле клетки. Но для этого мы должны использовать кислород: электрод окисляется, и наш зонд начинает потреблять больше кислорода, чем клетка. Особенность нанометровых систем в том, что они настолько маленькие, что их влияние становится практически ничтожным. За счет высокой чувствительности мы можем измерять практически без какого-либо воздействия с образцом – диффузия получается гораздо более быстрой.



Воздействие нанокапилляров одно из самых мягких. Мы не добавляем никаких химических веществ, а просто измеряем то, что есть. Можно даже померить одну биомолекулу и знать, что с ней происходит. Поэтому в мире большое внимание уделяется нанотехнологиям для создания биосенсоров, производящие измерения для биологических и медицинских целей.

— То есть, клетка не только туда попадает живой и подвергается измерениям, но и в процессе ей не наносится никакого ощутимого вреда? Она остается живой и дальше?

— Абсолютно верно, мы можем записывать данные по 24 часа. Мы можем использовать этот метод для стволовых клеток. Сейчас в большом количестве выращивают стволовые клетки для возможного лечения. Но есть проблема с ними – у вас получается не одиночная клеточная линия. Одни начинают дифференцироваться и производить нейроны, другие становятся чем-то другим, и все они в разных стадиях. В этом случае нужен анализ одной клетки – и ее важно не убить, чтобы посмотреть, что с ней будет завтра, послезавтра. Поэтому если мы можем не только картинку, но и узнать, что она делает в этот момент, – это идеально.

Даже когда мы делаем какую-то биопсию или входим внутрь клетки, это небольшое повреждение. Зонд может быть убран из клетки, и она продолжит работать точно также, как работала до этого. Но это известно, и в электрофизиологии часто вводят определенные маркеры, чтобы следить, как работают, например, ионные каналы. И клетки даже в этих случаях могут оставаться относительно в безопасности.

Если нанокапилляры входят в клетку, или даже в ядро, что вообще для клетки довольно опасно, они на удивление быстро «залечивают» маленькие повреждения.

— Липидная мембрана восстанавливает свою целостность и смыкается снова.

— Да, может выщипываться маленький кусочек, пара белков, но клетка обновляет свою поверхность в течение двух часов практически полностью. То же искусственное оплодотворение – мы вообще всовываем что-то в другую клетку, меняем ядро, и после этого она не только не погибает, но и часто вырастает в новый организм. Так что даже после вмешательства во внутреннюю жизнь клетки она может восстановиться. Но это уже крайние меры – для этого нужно проникнуть через барьер клеточной оболочки. Большинство исследований мы производим на расстоянии.

Как работает нанотаможня

— По каналам нанокапилляров течет жидкость, но их могут закупоривать разные молекулы, которые в них попадают. Даже небольшая молекула ДНК, скажем, вируса, может заблокировать его, и он перестанет работать. Вы не сталкивались с этим? Как вы решаете эту проблему?

— Мы очень хорошо можем подбирать размеры капилляров под то, что мы доставляем. Много знаем об электрических свойствах таких систем. Как раз с ДНК проще всего: мы можем контролировать и скорость, и доставку.

Есть даже способ траппинга, когда под определенным полем мы можем сконцентрировать ДНК в кончике зонда, и потом выбросить в определенную точку. Сейчас мы отправили статью, где мы измеряли одиночные белки антителами. Особенность капилляра в том, что на кончике создается нанопора, она не забивается, потому что она слишком маленькая.

Скажем так: у всех клеток есть ионные каналы – рецепторы, которые транспортируют ионы. И они ничем не задеваются, в них не застревают большие молекулы. Почему? Все потому, что они меньше, чем большинство частичек, которые могут их заблокировать. Так и у нас: вы изначально имеете фильтр по размеру вашего сенсора. Мелкие могут легко пройти, а большие никогда не проникнут внутрь. По сути дела, это искусственный рецептор.

Мы как раз работаем над частью этих так называемых искусственных рецепторов, построенных на специальных молекулах, которые могут узнавать, скажем, оптомеры. Это такие куски ДНК, которые используются для определения некоторых белков или молекул, потому что они могут очень хорошо избирательно с ними связываться и их можно использовать в таких тонких капиллярах.

Второй способ – так называемый импринтинг. Представьте, что у вас есть ключ и пластилин: вы оставляете отпечаток, и к нему только определенный ключ будет подходить. Таким же образом можно «импринтить» молекулы в определенной матрице, и потом у вас получается искусственный рецептор. Это один из самых дешевых и быстрых способов. Сейчас мы достигли неплохих результатов с АТФ и с более мелкими молекулами и пытаемся подобрать условия для работы с более крупными.

— А как информация от сенсора поступает к вам, на его другой конец?

— Они бывают очень разные. Представьте, что вы декорировали пору, очень маленькие отверстия специальной формы на кончике капилляра. У нас есть в этой поре сенсорные элементы, например, антитело, которое связывает определенный белок. Что происходит дальше: мы добавляем какие-то белки, когда белки транспортируются через крупную пору, они очень быстро проходят, фактически их не зафиксировать – они вызывают кратчайший всплеск длиной в микросекунды.


Продолжение материала о нанокапиллярах для изучения живой клетки читайте на сайте Indicator.Ru.


Автор — Екатерина Мищенко

Подписывайтесь на Indicator.Ru в соцсетях: Facebook, ВКонтакте, Twitter, Telegram., Одноклассники
Subscribe

Recent Posts from This Journal

  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic
  • 13 comments